血清對ELISPOT檢測的干擾

一直以來，ELISPOT檢測對于血清的影響都是眾說紛紜，利弊各執(zhí)一詞。一方面，淋巴細(xì)胞在體外的存活離不開血清的營養(yǎng)， ELISPOT檢測中細(xì)胞要在孔中孵育一兩天，所以培養(yǎng)基中需要添加血清；另一方面，血清中含有許許多多未知成分能夠抑制或者額外刺激淋巴細(xì)胞從而干擾ELISPOT檢測，尤其在針對一些臨床樣本的ELISPOT檢測中影響更不容忽視！由于血清是半天然的生物制品，它的質(zhì)量受采集的動(dòng)物個(gè)體差異的影響。所以，即使同一個(gè)公司同一級別的血清產(chǎn)品，不同批次之間對ELISPOT的影響也是各不相同的。

血清這種或者抑制或者額外刺激斑點(diǎn)的性質(zhì)，很讓人困惑。以前人們推測是因?yàn)檠謇锩婧懈鞣N牛的細(xì)胞因子，它與其它種屬的細(xì)胞因子受體有交叉反應(yīng)，可以激活或者抑制相應(yīng)的待檢測細(xì)胞?，F(xiàn)在對于TLR受體及其信號機(jī)制了解更深刻之后，似乎內(nèi)源性TLR供體是一個(gè)更可能的原因。TLR供體不僅僅指來源于外源的病原體，哺乳動(dòng)物自身可以表達(dá)一系列的TLR供體而激活TLR信號通路。這些內(nèi)源性的TLR供體包括IL-1α、IL-1β、β-defensin2、HSP60、HSP70、Fibirinogen、透明質(zhì)酸上的寡糖（Oligosaccharides of hyaluronic acid）、一種纖維連接蛋白上的結(jié)構(gòu)域（Type III repeat extra domain A of fibronectin）、肝素上的多糖（Polysaccharide fragment of heparan sulphate）、CpG染色質(zhì)IgG2a復(fù)合體。（Jiang, Z. et. al., 2003；Bulut, Y. et. al., 2001；Biragyn, A. et. al., 2002；Okamura, Y. et. al., 2001；Johnson, G. B. et. al., 2002；Xu, H. et. al., 2003）。

為什么說，內(nèi)源性TLR供體比細(xì)胞因子更可能對胎牛血清的干擾效應(yīng)負(fù)責(zé)呢？因?yàn)槲覀冎兰?xì)胞因子及其受體的種屬特異性是很強(qiáng)的，并且細(xì)胞因子的穩(wěn)定性差，容易失活。而相應(yīng)的內(nèi)源性TLR供體——比如HSP60/70、透明質(zhì)酸上的寡糖、肝素上的多糖——在進(jìn)化上要保守得多，種屬間沒有什么差異。所以牛表達(dá)的這些TLR供體刺激人或者鼠或者猴子的白細(xì)胞上的TLR幾乎與種屬內(nèi)的刺激有相同的效果。另外，牛TLR供體的穩(wěn)定性好得多，不會(huì)在血清保存或者滅活補(bǔ)體的過程中失活。

在這近20年的時(shí)間里，人們只能采用繁瑣的辦法來努力消除血清的干擾。具體做法是從全世界不同的血清供應(yīng)商那里索取各種不同批次的血清樣品，然后逐一做ELISPOT對比實(shí)驗(yàn)，找出干擾小、重復(fù)性好的血清品種與批次。然后就大量購買該品種、該批次的血清，以后每次都用它做檢測。直至該批次血清用盡，然后再開始下一輪的比較與采購。為了ELISPOT檢測結(jié)果的連貫性，通常會(huì)保留少許上批次的血清，用以作下輪比較的參照。

血清就是這樣困擾著ELISPOT技術(shù)將近20年。人們一直渴望有一種化學(xué)成分完全限定，對ELISPOT沒有任何干擾的，批次間影響完全相同的培養(yǎng)基，以徹底消除血清對ELISPOT技術(shù)的干擾，于是就催生了無血清ELISPOT技術(shù)。在最近兩三年的進(jìn)步與實(shí)踐中，無血清ELISPOT技術(shù)經(jīng)歷諸多考驗(yàn)，已經(jīng)成熟。